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01.什么是基因融合

基因融合是指兩個(gè)基因的部分或全部序列相互融合為一個(gè)新的基因的過(guò)程。一定比例的融合基因會(huì)被轉(zhuǎn)錄成嵌合融合轉(zhuǎn)錄物，這些嵌合融合轉(zhuǎn)錄物可以通過(guò)保留其親本基因的閱讀框架形成融合蛋白，可以影響親本基因表達(dá)或作為長(zhǎng)的非編碼嵌合RNA發(fā)揮作用。

一般來(lái)說(shuō)，基因融合是指基因組層面的融合。但轉(zhuǎn)錄組層面也可能發(fā)生融合，主要是由于兩個(gè)不同基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA，由于某種原因融合在了一起，形成新的融合RNA，該RNA可能編碼蛋白，也可能為非編碼。而基因組層面產(chǎn)生的融合基因，根據(jù)融合的情況，可能表達(dá)，也可能不表達(dá)（如破壞了啟動(dòng)子區(qū)域或其他原因）。

▲融合基因示意圖

02.融合基因的產(chǎn)生機(jī)制

由于染色體層的重排或轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的錯(cuò)誤剪接所造成的。在DNA層面上的重排主要包括了6種形式:

1. 染色體內(nèi)的易位和染色體間的易位；

2. 大片段的插入；

3. 大片段缺失；

4. 串聯(lián)重復(fù)；

5. 倒置；

6. 染色體碎裂導(dǎo)致的復(fù)雜重排。

 ▲DNA層面上的重排形式

在RNA層面上，轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的“通讀事件”也可能產(chǎn)生融合蛋白。當(dāng)RNA聚合酶不能正確終止一個(gè)基因末端的轉(zhuǎn)錄，并且由于異常剪接而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄到下一個(gè)基因末端時(shí)，產(chǎn)生了嵌合轉(zhuǎn)錄子稱之為“通讀事件”，并不涉及基因組物質(zhì)的重排(DNA重排)即可產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄子。

 ▲轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的“通讀事件”

03.融合基因常見(jiàn)檢測(cè)方法

FISH

通過(guò)熒光標(biāo)記的探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA 靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析基因擴(kuò)增或融合變異的一種分子檢測(cè)技術(shù)，一般被認(rèn)為是檢測(cè)基因擴(kuò)增和融合的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但也存在一定的局限性。如并非所有檢測(cè)到的融合均會(huì)產(chǎn)生可表達(dá)的融合RNA，分離探針可能會(huì)遺漏較小的染色體內(nèi)重排導(dǎo)致假陰性結(jié)果，無(wú)法確定和區(qū)分不同的融合基因變異亞型等。

IHC

利用抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，檢測(cè)組織或細(xì)胞學(xué)切片中特定蛋白表達(dá)的技術(shù)。IHC檢測(cè)靈敏度高、成本低、檢測(cè)時(shí)間短、易于自動(dòng)化，但其準(zhǔn)確性取決于檢測(cè)的融合蛋白是否有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的抗體，如VentanaD5F3 IHC檢測(cè)肺腺癌患者ALK 融合的準(zhǔn)確性高，而 ROS1和NTRK陽(yáng)性IHC結(jié)果尚需其他檢測(cè)方法驗(yàn)證。

RT-PCR

在RNA水平檢測(cè)融合RNA，靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短，但僅限于檢測(cè)引物設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的已知融合，無(wú)法檢出未知融合。此外，該方法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性高度依賴標(biāo)本RNA的質(zhì)量。

靶向二代測(cè)序

通過(guò)大規(guī)模平行測(cè)序的方法，對(duì)引物或探針設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的區(qū)域同時(shí)進(jìn)行多個(gè)融合基因檢測(cè)。根據(jù)核酸投入物的不同，靶向二代測(cè)序可在DNA或RNA水平檢測(cè)基因融合。

根據(jù)中心法則，以DNA為模板通過(guò)轉(zhuǎn)錄和剪接加工產(chǎn)生成熟的RNA。在DNA水平上，融合斷點(diǎn)位置通常發(fā)生在較長(zhǎng)的內(nèi)含子區(qū)域，且融合的斷裂點(diǎn)不同患者可能不同，故用傳統(tǒng)的PCR直接擴(kuò)增斷裂點(diǎn)是不易實(shí)現(xiàn)的，采用NGS的方法設(shè)計(jì)探針去抓取斷裂點(diǎn)是一種可行的檢測(cè)方法，但從DNA水平檢測(cè)融合基因不可避免存在如下局限性和挑戰(zhàn)：

1.融合基因的斷點(diǎn)一般在內(nèi)含子區(qū)域，而融合基因的內(nèi)含子又特別冗長(zhǎng)，因此，如果基于DNA-based的檢測(cè)方法就要在內(nèi)含子區(qū)域鋪設(shè)大量的探針，探針設(shè)計(jì)難度大。

2.大量探針也會(huì)導(dǎo)致下機(jī)數(shù)據(jù)量過(guò)大（增加實(shí)驗(yàn)成本，加大生信分析難度）。

3.大量探針仍會(huì)存在覆蓋盲點(diǎn)，導(dǎo)致融合漏檢。

4.DNA層面出現(xiàn)融合不一定能轉(zhuǎn)錄成mRNA進(jìn)而翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而不能激活下游MAPK/mTOR通路，而RNA則相對(duì)更接近翻譯成為蛋白質(zhì)。

相比DNA水平，RNA水平上融合基因表現(xiàn)為前后兩個(gè)基因外顯子之間的銜接，融合點(diǎn)相對(duì)固定。這一特征為精準(zhǔn)設(shè)計(jì)探針或引物提供了先天優(yōu)勢(shì)。因此，根據(jù)融合基因序列特點(diǎn)，在RNA水平上檢測(cè)融合基因比DNA水平更易實(shí)現(xiàn)。

 ▲融合基因常見(jiàn)的檢測(cè)方法

04.融合基因檢測(cè)：DNA vs RNA

DNA-based NGS

原理：對(duì)可能發(fā)生融合的區(qū)域設(shè)計(jì)探針進(jìn)行覆蓋，雜交捕獲得到目的片段進(jìn)行測(cè)序分析。

通過(guò)雜交捕獲建庫(kù)，僅使用DNA就可同時(shí)對(duì)多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的突變、擴(kuò)增、融合及腫瘤突變負(fù)荷（TMB）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，極大地節(jié)約了標(biāo)本量，并且能夠在DNA水平確定基因融合的斷點(diǎn)位置和融合伴侶，檢出已知和未知的基因融合。DNA-based NGS測(cè)序是基于腫瘤細(xì)胞來(lái)源的DNA分子進(jìn)行檢測(cè)。DNA分子由螺旋的雙鏈組成，相對(duì)于RNA更加穩(wěn)定。因此，DNA-based NGS的組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)樣本，包括新鮮組織、FFPE、胸水等，均可滿足檢測(cè)質(zhì)控要求。在組織樣本難以獲取或樣本量不足時(shí)，還可以通過(guò)液體活檢提取ctDNA進(jìn)行測(cè)序，而這是RNA-based NGS無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。但是，DNA二代測(cè)序檢測(cè)基因融合受腫瘤細(xì)胞含量、標(biāo)本DNA質(zhì)量、捕獲探針覆蓋度及DNA層面復(fù)雜基因變異等影響，可能會(huì)出現(xiàn)漏檢。另外，隨著DNA二代測(cè)序在臨床分子檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多攜帶罕見(jiàn)伴侶的激酶融合被發(fā)現(xiàn)，但某些罕見(jiàn)融合并不能產(chǎn)生有功能的融合RNA/蛋白。

RNA-based NGS

RNA二代測(cè)序可以通過(guò)多重PCR擴(kuò)增、錨定多重PCR或雜交捕獲建庫(kù)在RNA水平檢測(cè)融合轉(zhuǎn)錄本。與DNA二代測(cè)序需要對(duì)外顯子和內(nèi)含子區(qū)均進(jìn)行探針捕獲相比，RNA測(cè)序僅需要針對(duì)外顯子區(qū)設(shè)計(jì)引物或探針，相對(duì)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，不受DNA層面復(fù)雜融合的影響，且RNA二代測(cè)序能直接真實(shí)地反映轉(zhuǎn)錄水平融合的表達(dá)情況及融合伴侶基因類(lèi)型。

但是，RNA-based NGS檢測(cè)樣本要求相對(duì)較高。從樣本質(zhì)量上講，由于存在核糖核酸酶且RNA是單鏈結(jié)構(gòu)，非常容易降解，因此，新鮮組織是做RNA-based NGS檢測(cè)的******。有研究表明，高達(dá)50%的存檔FFPE樣本，特別是較舊的樣本，不能滿足RNA建庫(kù)和測(cè)序的要求，可能無(wú)法通過(guò)測(cè)序前的質(zhì)量控制。目前尚不推薦從液體活檢樣本中提取RNA進(jìn)行腫瘤融合基因檢測(cè)，這也限制了RNA-based NGS檢測(cè)的應(yīng)用。

紐約紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥研究中心（MSKCC）的一項(xiàng)真實(shí)世界肺腺癌大隊(duì)列研究和一項(xiàng)中國(guó)人群的研究中均通過(guò)RNA-based NGS在DNA NGS檢測(cè)陰性的非小細(xì)胞肺癌樣本中檢出了10%左右的靶點(diǎn)基因融合或MET跳突，相比DNA水平，RNA水平上融合基因表現(xiàn)為前后兩個(gè)基因外顯子之間的銜接，不受內(nèi)含子的影響，融合點(diǎn)相對(duì)固定，這一特征為精準(zhǔn)設(shè)計(jì)探針或引物提供了先天優(yōu)勢(shì)，也是RNA-based NGS比DNA-based NGS檢測(cè)融合基因更具優(yōu)勢(shì)的原因之一。

 ▲紐約紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥研究中心研究

 ▲中國(guó)人群研究

 ▲NGS檢測(cè)基因融合對(duì)比

05.總結(jié)

相比DNA-based NGS，RNA-based NGS不受內(nèi)含子影響，可提升融合基因的檢出率。融合基因DNA和RNA水平上的結(jié)構(gòu)特征決定了融合基因檢測(cè)，RNA水平遠(yuǎn)比DNA水平更敏感，更準(zhǔn)確，但是樣本要求較高。

DNA-based NGS對(duì)樣本要求相對(duì)較低，可聯(lián)合其他biomarker共同檢測(cè)，同時(shí)DNA層面可檢出的罕見(jiàn)融合伴侶、外顯子斷點(diǎn)融合及基因間融合，但需在RNA或蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證。

在臨床應(yīng)用中，全面準(zhǔn)確地腫瘤靶基因檢測(cè)需要臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累以及不斷的總結(jié)驗(yàn)證?；跈z測(cè)方法學(xué)的局限性和檢測(cè)標(biāo)本的復(fù)雜性，多平臺(tái)聯(lián)合應(yīng)用或補(bǔ)充有益于腫瘤患者的精準(zhǔn)診治。

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